Elokuva sijoittuu vuoteen 1938. Indiana Jones (Harrison Ford) saa tietää, että hänen isänsä, professori Henry Jones vanhempi (Sean Connery), on kadonnut etsiessään legendaarista Pyhää Graalin maljaa – maljaa, josta Jeesuksen uskotaan juoneen viimeisellä aterialla ja joka antaa juojalleen ikuisen elämän.
Indy matkustaa Venetsiaan isänsä päiväkirjan opastamana ja löytää tämän natsien vangitsemana synkästä saksalaisesta linnasta. Isä ja poika joutuvat unohtamaan vanhat kaunansa, pakenemaan natseja läpi Euroopan ja kilpailemaan aikaa vastaan löytääkseen Graalin maljan salaisen temppelin ennen Hitlerin joukkoja.
Elokuvan ehdoton sydän ja menestystekijä on Harrison Fordin ja Sean Conneryn välinen loistava kemia. He heittävät jatkuvasti humoristista herjaa toisilleen kesken vaarallisimpienkin takaa-ajojen.
Connery esittää Fordin isää, vaikka todellisuudessa näyttelijöillä oli ikäeroa vain 12 vuotta. Connery oli kuvausten aikana 58-vuotias ja Ford 46-vuotias.
Kuuluisassa ilmalaivakohtauksessa näyttelijät istuvat pöydän ääressä keskustelemassa. Koska studiolla oli tukahduttavan kuuma, Connery (ja perässä Ford) riisui housunsa ja kenkänsä, joten he näyttelivät vakavan kohtauksen pelkissä kalsareissa kameran kuvatessa vain vyötäröstä ylöspäin.
Elokuvan upea avauskohtaus sijoittuu vuoteen 1912, jossa nuorta Indya esittää edesmennyt lahjakkuus River Phoenix. Kohtaus selittää, mistä Indy sai lierihattunsa, ruoskansa, leuan arpensä sekä käärmekammona.
Indy ja tohtori Elsa Schneider (Alison Doody) kahlaavat Venetsian kirjaston alla tuhansien rottien seassa. Kohtausta varten kasvatettiin tuhansia tautivapaita laboratoriorottia.
Elokuvan loppuhuipennuksessa Indyn täytyy selvitä kolmesta kuolemanvaarallisesta ansasta (Jumalan henkäys, Jumalan sana ja Jumalan polku) päästäkseen maljan luo.
Kun natsiliittolainen Walter Donovan juo väärästä, kultaisesta maljasta, Graalin vartijaritari toteaa ikonisesti: "He chose poorly" (Hän valitsi huonosti) Donovanin vanhetessa ja lahotessa tomuksi sekunneissa.
Elokuvan loppuhuipennus kuvattiin Jordanian autiomaassa sijaitsevassa Petran muinaiskaupungissa.Elokuvassa nähtävä Graalin temppelin julkisivu on todellisuudessa Al-Khazneh eli "Aarrearkku". Elokuvan valtava suosio räjäytti Petran matkailun, ja paikka on nykyään yksi maailman seitsemästä uudesta ihmeestä.
